雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘,并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次,同時(shí)應(yīng)避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時(shí)。此時(shí)已可進(jìn)行自顯影。如背景很高或?qū)嶒?yàn)要求嚴(yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號(hào)面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個(gè)不對(duì)稱的標(biāo)記,以使濾膜與性自顯影片位置對(duì)應(yīng)。
用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時(shí)。
底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號(hào)的位置,提供酵母雙雜交技術(shù)服務(wù),同時(shí)在不對(duì)稱分布點(diǎn)的位置上作出標(biāo)記??蓮牡灼先∠峦该骷?,通過對(duì)比紙上的點(diǎn)與瓊脂上的點(diǎn)來鑒定陽性菌落。
適用場(chǎng)景
1、高靈敏度地檢測(cè)蛋白-蛋白的交互作用;
2、尋找在蛋白-蛋白交互作用中起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域或活性位點(diǎn);
3、尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白;
4、尋找具有藥1物治1療作用的小分子多肽;
5、尋找調(diào)控蛋白質(zhì)相互作用的化合物;
6、繪制蛋白質(zhì)相互作用圖譜。
酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)
1、無需純化蛋白;
2、檢測(cè)在活1細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,可以在一定程度上代表體內(nèi)的真實(shí)情況;
3、檢測(cè)的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng),因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用;
4、酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器1官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫(kù),并能分析細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等多種亞細(xì)胞部位的蛋白。
分子病理學(xué)是與分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等學(xué)科相互滲透,在蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子水平上研究疾病病因、發(fā)病機(jī)制、形態(tài)變化及功能損害等方面發(fā)生和發(fā)展規(guī)律的新的分支學(xué)科,對(duì)疾病的病因、發(fā)展、發(fā)病機(jī)制及形態(tài)變化,從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)概念深入至分子或基因水平,分子病理已成為腫1瘤病理研究中重要的內(nèi)容和手段。①細(xì)胞特異性mRNA轉(zhuǎn)錄的定位,可用于基因圖譜,基因表達(dá)和基因組進(jìn)化的研究;
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